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核酸DNA的定量分析

数据分析 作者:toto19850202 时间:2012-09-08 15:36:00 0 删除 编辑

核酸的定量主要采用紫外分光光度法及电泳比较法。组成核酸分子的碱基,均具有一定的吸收紫外线特性,最大吸收值为250~270nm之间。例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm,胞嘧啶:267nm,鸟嘌呤:276nm,胸腺嘧啶:264.5nm,尿嘧啶:259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后,其最大吸收峰不会改变,但核酸的最大吸收波长是260nm,吸收低谷在230nm,这个物理特性为测定核酸溶液度提供了基础。
在260nm波长紫外光下,1A值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml;单链DNA或RNA为40μg/ml;单链寡核苷酸为20μg/ml。可以由此计算核酸样品的浓度(紫外分光光度法)。
质粒DNA及微量DNA片段的浓度还可以通过与已知浓度的DNA标准同时进行电泳,根据其结合的溴乙锭荧光强度,估计其样品的浓度(电泳法)。

工具/原料

  •  仪器与器材
    1. 紫外分光光度计,微量石英比色皿 2. 电泳仪,电泳槽,紫外灯。


  • 1. 6×点样缓冲液:0.25%溴酚兰、40%蔗糖
    2. DNA分子量标准:λDNA/HindⅢ
    3. 50×TAE电泳缓冲液贮存液配方:(50×)每升
    242g Tris, 57.1ml 冰醋酸, 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
    1×缓冲液浓度:0.04mol/L Tris-HAc、0.002mol/L EDTA
    4. 0.8%琼脂糖凝胶:0.8g琼脂糖用100ml 1×TAE沸水浴溶解
    5. 10mg/ml EB: 1.0g 溴乙锭 100ml 三蒸水

方法/步骤

  1. 1

    (一)紫外分光光度法: 略。

  2. 2

    (二)琼脂糖凝胶电泳比较法:若DNA样品中含RNA或其它杂质,凝胶电泳是一种方便而较准确的定量方法。

  3. 3

    1. 取2μlDNA样品,加0.4μl电泳上样缓冲液(含溴酚蓝),混匀后加样于含0.5μg/ml溴乙锭的琼脂糖微型电泳凝胶的孔格内。

  4. 4

    2. 取一系列浓度不同的2μl标准DNA样品(0.5~50μg/ml)0.4μl上样缓冲液混合上样。标准DNA溶液中,应含有一种与样品DNA分子量大小相近似的DNA分子。

  5. 5

    3. 电泳:使DNA移入琼脂糖胶内。一般为溴酚蓝迁移2cm左右。

  6. 6

    4. 将凝胶浸入含0.01mol/L MgCl2的电泳缓冲液中5分钟,进行背景脱色。

  7. 7

    5. 在短波紫外线(254nm)下进行拍照,比较样品DNA与DNA的标准品的荧光强度,并计算出待测样品中DNA浓度。
    荧光法灵敏快速。但它的荧光强度决定于溴乙锭嵌入碱基中的多少,这与DNA的超螺旋程度密切相关,标准与样品难以完全一致,并且还受其它影响荧光发光污染物的影响。

    END

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